Ciertas enzimas se unen únicamente a determinados sustratos. Hay 4 tipos de especificidad, son especificidad absoluta, especificidad de grupo, especificidad de enlace y especificidad estereoquímica dependiendo de sus sitios estéricos, número de reacciones que sufren, grupos, tipo de enlace que forman.
El sustrato es relativamente más pequeño que la enzima. Por lo tanto, el sustrato se une a una porción de la enzima. El sustrato está unido a la enzima con fuerzas de enlace débiles, como enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas e interacciones dipolo-dipolo. Los sustratos suelen ser complementarios a las enzimas. Sin embargo, es posible que no encajen perfectamente entre sí. Estas fuerzas de unión ayudan a que el complejo sea más estable. En el caso de reacciones de dos sustratos que involucran complejos ternarios, dos sustratos deben estar unidos uno cerca del otro para preceder a la reacción. Es imposible que la reacción continúe si dos sustratos no son adyacentes o están espacialmente cerca uno del otro. En este caso, la enzima debería tener cierta especificidad estérica.
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